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大黃素對脂多糖所致腎臟炎癥的抑制作用研究

 [摘要] 目的 探討大黃素對脂多糖(LPS)誘導的腎小管上皮細胞(TECs)免疫炎癥的抑制作用。 方法 原代培養的BALB/C小鼠腎小管上皮細胞,模型組用100 ng/mL的LPS誘導,干預組在LPS誘導的同時,分別用0.1、0.2、0.4 μg/mL濃度的大黃素干預,于24 h后分別提取細胞總RNA及蛋白。用流式細胞術檢測TEC TLR4膜蛋白水平,逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測樣受體(TLR)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)mRNA的表達。 結果 正常腎小管上皮細胞可見TLR4表達,用100 ng/mL LPS刺激后TLR4 mRNA的表達由(0.25±0.22)上調至(0.62±0.11),且TNF-α、IL-6因子表達亦分別上調6.4倍和2.1倍,與正常組比較,差異有統計學意義(P < 0.05)。不同濃度大黃素干預后則TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA表達較模型組下降2.0~5.7倍,與模型組比較,差異有統計學意義(P < 0.05),下降程度與大黃素濃度相關,部分存在一定的量效依賴關系。 結論 大黃素能夠下調LPS誘導的腎小管上皮細胞TLR4的表達,并減少下游炎癥因子TNF-α及IL-6的激活,從而減輕腎臟局部免疫炎癥反應、保護腎功能。 
  [關鍵詞] 大黃素;脂多糖;Toll樣受體4;腎小管上皮細胞 
  [中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2013)12(c)-0008-04 
  The inhibition effect of Emodin to lipopolysaccharide-induced renal inflammation 
  YANG Yazhen ZHU Xiaoling WANG Yongjun YANG Ruchun 
  Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhejiang Province, Hangzhou 310007, China 
  [Abstract] Objective To investigate the effect of Emodin on inflammation in cultured mice tubular epithelial cells (TECs) induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods TECs were obtained from BALB/C mice, the TECs were incubated with LPS (100 ng/mL) and/or indicated concentration of emodin (0.1, 0.2, 0.4 μg/mL) for 24 hours, then, the total RNA and protein were extracted. TLR4 protein was detected with flow cytometry, mRNA expression of TLR4, TNF-α and IL-6 was detected using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The TLR4 mRNA expression was detected in normal TECs. After stimulating by LPS of 100 ng/ml, the expression was regulated upward significantly from (0.25±0.22) to (0.62±0.11) when the expressions of TNF-α, IL-6 also increased by 6.4 and 2.1 times respectively(P < 0.05). And the expressions of TLR4, TNF-α and IL-6 mRNA induced by LPS could be decreased by 2.0 to 5.7 times in the pretreated group with Emodin of different concentration, which compared with model group (P < 0.05); and the descending degree varied according to the different concentration of Emodin with part of them showing the dose-reponse relationship. Conclusion Emodin can inhibit LPS induced expression of TLR4 to downregulate TNF-α and IL-6 synthesis in TECs, then decrease the kidney inflammation, which may contribute to the protective effects of emodin in renal disease. 
  [Key words] Emodin; Lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; Tubular epithelial cells. 
  腎小管上皮細胞的損傷不僅是急性腎衰竭的直接原因,而且可導致或加重腎小管間質病變,決定各種腎臟病的預后[1]。而革蘭陰性細菌產生的脂多糖(LPS)作為TLR4的天然配體,是重要的致炎因子,可激活TLR4信號轉導通路介導膀胱上皮細胞和腎小管及集合管上皮細胞產生典型的以炎性反應和抗炎癥反應細胞因子分泌增多為特征的級聯反應[2]。大黃素(1,3,8-三羥基-6甲基蒽醌),是從大黃屬、蓼屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來的主要有效單體,研究發現大黃素具有抗菌抗炎[3]、抗腫瘤[4]、抑制細胞增殖提高免疫[5]、保護肝腎[6]等廣泛的藥理作用。但對大黃素拮抗腎臟免疫炎癥的作用及其可能的機制研究尚少,本研究利用LPS刺激腎小管上皮細胞,觀察LPS信號轉導受體TLR4及炎癥因子的表達變化,進一步研究大黃素對此的拮抗作用。1 材料與方法 
  1.1 主要試劑及來源 
  DMEM/F12培養液、胎牛血清(FCS)購自美國GIBCO Brl公司;RT-PCR所用試劑購自上海生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗試劑盒:美國Promega公司;大黃素購自中國藥品生物制品檢定所(批號877-9901)。 
  1.2 細胞培養 
  腎小管上皮細胞原代培養方法從英國皇家學院Guy's醫院引進。取實驗用6周齡BALB/C雄性小鼠(上海實驗動物中心提供),體重(18±2)g。禁食12 h后無菌條件下取皮質,去除腎髓質。將腎皮質剪碎后加入0.1%Ⅱ型膠原酶10 mL,震蕩消化20 min,置80目不銹鋼網篩上研磨,收集過篩懸液,經150目、200目鋼篩及40 μm尼龍網篩再濾過,收集40 μm尼龍網篩上物并移至15 mL離心管中,4℃,1500 r/min離心5 min后取沉淀物加入含2%胎牛血清的DMEM/F12培養液5 mL,混勻,置培養瓶入37℃,5%CO2細胞培養箱中孵育,2~3 d后可見腎小管上皮細胞貼壁后換液,7 d后細胞長到90%融合時即用于實驗。 
  1.3 用LDH釋放實驗(Promega公司)測定大黃素對細胞的毒性作用 
  設試驗組(含有大黃素培養液的濃度分別為1∶1、1∶2、1∶4)、自然釋放組和最大釋放組,分別加入等濃度的細胞懸液50 μL于96孔板,自然釋放組以DMEM/F12培養液代含有大黃素的培養液,最大釋放組以2%Triton代含有大黃素的培養液,置37℃,5%CO2細胞培養箱中1 h,加50 μL終止液,置室溫30 min,酶標儀490 nm測各孔吸光值(OD490)。細胞毒性=(試驗組OD490-自然釋放組OD490)/(最大釋放組OD490-自然釋放組OD490)×100%。 
  1.4 實驗分組及干預 
  將培養的腎小管上皮細胞隨機分為正常對照組、模型組及干預組。正常對照組給與正常培養液,模型組則加用100 ng/mL的LPS刺激(刺激濃度據文獻及前期試驗而定),干預組在LPS刺激基礎上分別加入0.4、0.2、0.1 μg/mL大黃素干預。干預后細胞相同條件下繼續培養24 h,棄上清,提取細胞總RNA或蛋白檢測相關數據,實驗均重復進行3次。 
  1.5 流式細胞術檢測TLR4膜蛋白 
  將小鼠腎小管上皮細胞懸液濃度調整為5.0×106/mL,每管取100 μL,1500 r/min,離心5 min,棄上清液,加入PE-TLR4 5μL、PE- IgG 25 μL(eBioscience公司),4℃孵育30 min,加PBS后,1500 r/min,離心5 min,棄上清液,2%甲醛500 μL固定,過濾后上機(Beckman-Coulter公司)檢測。 
  

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